分子动力学（cell）--靶向CCKBR通路的选择性偏向性激动策略在阿尔茨海默病治疗中的机制研究
### 作者，Evil Genius ### 接下来要为我们的生化小课，分子对接/分子动力学做好准备，我自己做了一个合集，在[分子动力学](https://mp.weixin.qq.com/mp/appmsgalbum?__biz=Mzg2MDY1NTYyOQ==&action=getalbum&album_id=4563499736439504899#wechat_redirect)，大家感兴趣可以看看，那是那句话，我们先把事情做好，再说其他的事情。 ### 我们任何人都一样，学习一些内容要认真学，学会，不达目的不罢休，不学就彻底不学，好好玩一玩，养好身体，放松心态，不要半学不学，一知半解这个状态，两头都不沾，浪费时间精力金钱，最后还是不会。 ### 我一个没工作，更不可能有编制的人，都在学习这些内容，有没有收益我根本不知道；但是大家如果在学生时代，或者编制内，学习这些生信内容的价值不可估量，我是错过了，研究生的方向一点都不感兴趣，平台也比较低，也没人带，天天易错PCR筛选突变体，一点技术含量都没有，搞得自己以后再也不想做实验了，现在学习的内容才明白当初的自己是多么的low；大家如果在课题组，有人带，有资源，自己再学习一点，起点真的高出普通人太多了。 ### 如果想着先工作几年，或者做科研助理等名额，基本走不通。 ### 今日参考文献  ### 知识积累 ### 表达于内嗅皮层（entorhinal cortex, EC）中的胆囊收缩素B型受体（cholecystokinin B receptor, CCKBR）在记忆和学习过程中发挥重要作用。本研究发现，与CCKBR-Gi信号通路不同，CCKBR-Gs和CCKBR-Gq信号通路对阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）的治疗具有积极作用。 ### 在临床研究中，发现，AD病情越严重的患者，其CCKBR-Gq信号活性越低。通过冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）技术，本研究解析了CCKBR与内源性激动剂硫酸化胆囊收缩素八肽（sulfated CCK8, CCK8s）以及3种不同G蛋白亚型复合物的结构，揭示了受体不同构象状态如何决定其对特定G蛋白的选择性偏向（G protein bias）。 ### 基于这些结构信息，理性设计并开发了多种CCKBR合成偏向性激动剂（synthetic biased agonists），其中包括： ### Gi偏向性激动剂（Gi-biased agonist）——z-44 ### Gq偏向性激动剂（Gq-biased agonist）——3r1 ### 值得注意的是，3r1表现出了显著的治疗潜力： ### 在5×FAD阿尔茨海默病小鼠模型中改善了认知功能下降； ### 减少了脑内β-淀粉样蛋白（amyloid-β, Aβ）斑块数量； ### 通过上调： ### α-分泌酶ADAM10（α-secretase） ### 钙信号分子PLCB4（phospholipase C beta 4） ### 促进了长时程增强（long-term potentiation, LTP），从而增强突触可塑性和学习记忆能力。 ### 学习（learning，指获取知识的过程）和记忆（memory，指保持信息的能力）是人脑的两项基本功能，它们受到特定脑区中神经递质/神经肽信号通路的调控。神经递质或神经肽的减少，以及其受体表达水平下降，尤其是在老年人群中，可能导致记忆功能障碍。 **胆囊收缩素（cholecystokinin, CCK）**是大脑中含量最丰富的神经肽之一，广泛分布于： ### 新皮层（neocortex） ### 杏仁核（amygdala） ### 丘脑（thalamus） ### 海马（hippocampus） ### 内嗅皮层（entorhinal cortex, EC） ### CCK参与神经传递，并调控多种脑功能，包括： ### 情绪调节 ### 学习和记忆 ### 焦虑 ### 恐惧反应 ### 其中，内嗅皮层（EC）是CCK高度富集的脑区，其主要功能是作为海马和新皮层之间的信息传递枢纽。此外，EC中大多数细胞均表达CCK。 ### CCK信号对学习和记忆的重要性体现在： ### Cck基因敲除小鼠 ### 在被动回避实验（passive avoidance task）中表现更差； ### 在Morris水迷宫（MWM）实验中出现空间记忆损伤。 ### 此前研究发现： ### EC参与听觉皮层人工视听记忆痕迹的编码和提取； ### 激活EC来源的CCK能神经元能够诱导： ### 长时程增强（LTP） ### 神经可塑性 ### 此外，CCK与CCK B型受体（CCKBR）的相互作用对于： ### 高频刺激诱导的LTP； ### 声音-声音关联记忆形成； ### 具有关键作用。 ### CCK存在多种神经肽变体，可激活不同G蛋白信号，包括： ### Gs ### Gq ### Gi ### 其中： ### 硫酸化CCK8（CCK8s）是脑内最丰富的CCK形式。 ### CCK与阿尔茨海默病（AD）的关系 ### 内嗅皮层（EC）是阿尔茨海默病早期受损的重要区域，其特点包括： ### 神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles）最早积累； ### 神经毡丝（neuropil threads）形成； ### 脑区萎缩； ### 神经元丢失。 ### 这些都是AD早期典型病理改变。 ### 此前研究发现： ### 反复给予CCK8s能够增强老年大鼠的空间学习和记忆能力。 ### 因此作者提出假设： ### 补充外源性CCK8s，增强CCK信号，可能具有改善AD进展的治疗作用。 ### 围绕CCKBR在AD中的作用开展研究： ### 1. 分析AD过程中CCKBR信号变化 ### 研究： ### AD患者和动物模型中CCKBR活性变化； ### 不同G蛋白信号通路（Gs/Gq/Gi）的作用。 ### 2. 研究CCKBR激动剂治疗AD的效果 ### 比较不同偏向性激动剂： |激动剂|信号偏向|作用| | --- | --- | --- | |z-44|Gi偏向|无明显AD改善作用| |3r1|Gq偏向|改善AD模型认知功能| ### 3. 解析CCKBR结构机制 ### 利用： ### 冷冻电镜（cryo-EM） ### 解析： ### CCK8s-CCKBR-Gs复合物； ### CCK8s-CCKBR-Gq复合物； ### CCK8s-CCKBR-Gi复合物。 ### 揭示： ### 不同CCKBR构象决定其选择性激活不同G蛋白通路。 ### 4. 基于结构设计偏向性药物 ### 利用结构信息设计： ### Gi偏向性CCKBR激动剂：z-44 ### Gq偏向性CCKBR激动剂：3r1 ### 结果发现： ### Gq信号激活具有治疗AD潜力，而Gi信号可能没有明显获益。 ### 文章核心逻辑 ``` CCK8s ↓ CCKBR受体 ↓ 选择性激活不同G蛋白 ↓ Gs / Gq → 神经保护、突触增强、LTP ↑ → 记忆改善 Gi → 无明显治疗作用 ↓ Gq偏向性激动剂3r1 ↓ ADAM10 ↑ PLCB4 ↑ Ca2+信号增强 ↓ LTP增强 ↓ Aβ斑块减少 ↓ AD小鼠认知改善 ``` ### 结果1、CCK通过激活脑内CCKBR缓解记忆衰退 ### 1. AD过程中CCK/CCKBR信号发生改变 ### 由于内嗅皮层（entorhinal cortex, EC）是AD最早发生病理改变的脑区之一，研究者首先分析AD进展过程中CCK信号变化。 ### 在晚期AD模型 5×FAD小鼠中发现： ### EC区域CCK表达下降约90% ### 与年龄匹配的正常小鼠相比显著降低； ### 相反： ### 海马和皮层区域CCKBR受体表达升高。 ### 说明： ### AD过程中，CCK配体减少，但CCKBR受体出现代偿性增加。 ### 2. CCKBR缺失导致学习记忆障碍 ### 研究CCKBR敲除小鼠： ### Cckbr-/- 小鼠 vs Cckbr+/+小鼠 ### 发现： ### 学习能力下降； ### 记忆能力下降； ### 海马和皮层区域LTP（长时程增强）减弱。 ### 提示： ### CCK-CCKBR信号缺陷与AD中的记忆损害密切相关。 ### 3. 外源性CCK8s可以保护神经元 ### 研究假设： ### 增强CCKBR活性可能减缓AD进程并保护神经元。 ### 但是： ### CCK8s不能穿过血脑屏障（BBB）； ### 长期硬膜外给药可能造成脑损伤。 ### 因此作者首先进行了体外实验。 ### Aβ诱导神经损伤模型 ### 使用： ### Aβ42处理原代皮层神经元 ### 结果： ### Aβ42 → 神经元存活率下降 ### 加入CCK8s： ### → 显著恢复神经元活性 ### 说明： ### CCK8s具有抵抗Aβ神经毒性的保护作用。 ### 4. CCK8s作用依赖CCKBR，而不是CCKAR ### 为了确定CCK受体类型： ### 阻断： ### CCKBR ### 使用： ### CCKBR拮抗剂 L365260 ### CCKBR shRNA敲低 ### 结果： ### → CCK8s神经保护作用明显下降。 ### CCKAR ### 使用： ### CCKAR拮抗剂 devazepide ### CCKAR shRNA敲低 ### 结果： ### → 不影响CCK8s保护作用。 ### 因此： ### CCK8s主要通过CCKBR发挥神经保护作用，而非CCKAR。 ### 5. CCKBR激活多个G蛋白信号 ### CCKBR属于GPCR受体，可以激活： ### Gs ### Gq ### Gi ### 通过： ### cAMP检测（Gs） ### AP-TGFα shedding检测（Gq） ### cAMP抑制实验（Gi） ### 发现： ### CCK8s能够同时激活CCKBR下游： |信号|激活情况| | --- | --- | |Gs|↑| |Gq|↑| |Gi|↑| ### 6. Gs和Gq负责神经保护，Gi作用相反 ### 进一步使用不同抑制剂： ### 阻断Gs： ### 药物： ### NF449 ### 结果： ### → CCK8s保护作用消失 ### 阻断Gq： ### 药物： ### PLC抑制剂U73122 ### 结果： ### → CCK8s保护作用消失 ### 阻断Gi： ### 药物： ### 百日咳毒素（PTX） ### 结果： ### → 神经元存活进一步增加 ### 说明： |信号通路|对AD保护作用| | --- | --- | |CCKBR-Gs|有益| |CCKBR-Gq|有益| |CCKBR-Gi|不利| ### 7. Gs/Gq促进神经结构恢复 ### 利用： ### Gnαq flox小鼠 ### Gnαs flox小鼠 ### Cckbr-Cre病毒 ### 特异性降低CCKBR神经元中的： ### Gs表达 ### Gq表达 ### 结果： ### 降低Gs/Gq： ### ↓ ### CCK8s保护作用消失： ### 轴突长度恢复下降； ### 树突棘形成减少； ### 细胞存活降低。 ### 说明： ### CCKBR介导的神经保护依赖Gs和Gq，而不是Gi。 ### 8. AD患者中CCKBR-Gq信号下降 ### 研究者进一步分析78名AD患者脑脊液（CSF）。 ### 分组： |组别|人数| | --- | --- | |轻度AD|39例| |重度AD|39例| ### 检测脑脊液多肽成分激活CCKBR能力。 ### 结果： ### CCKBR-Gq信号： ### 重度AD患者： ### ↓ 明显降低 ### CCKBR-Gi信号： ### 重度AD患者： ### ↑ 增强 ### 提示： ### AD进展过程中，CCKBR信号发生偏移：有益的Gq信号下降，而Gi信号增强。 ### 9. AD患者CCK8s减少导致Gq下降 ### 质谱分析CSF中的CCK肽： ### 检测： ### CCK8s ### CCK4 ### 结果： ### CCK8s： ### 重度AD： ### ↓↓降低 ### CCK4： ### 重度AD： ### ↑升高 ### 原因： - CCK8s倾向激活Gq； - CCK4可能产生不同G蛋白偏向。 ### 因此： ### AD晚期由于CCK8s减少，而CCK4增加，导致CCKBR-Gq活性下降。  ### 结果2、CCK8s-CCKBR-G蛋白复合物结构解析 ### 冷冻电镜解析CCKBR不同G蛋白复合物结构 ### 研究者解析了3种CCK8s-CCKBR复合物结构： ### CCK8s-CCKBR-Gq ### CCK8s-CCKBR-Gs ### CCK8s-CCKBR-Gi1 ### 分辨率分别达到： ### Gq：3.3 Å ### Gs：3.0 Å ### Gi：3.1 Å ### 虽然已有胃泌素（gastrin-17）-CCKBR-Gi/Gq结构，但： ### gastrin-17主要存在于胃肠道； ### CCK8s主要富集于脑内，并且激活CCKBR-Gq/Gs能力更强。 ### 因此，采用CCK8s-CCKBR-Gs/Gq/Gi结构研究脑内CCKBR信号偏向机制。 ### CCK8s不同结合模式决定G蛋白偏向性 ### 三种复合物中，CCK8s均呈现类似： ### “倒置鱼钩（inverted fish hook）”结构 ### C端F8深入受体结合口袋底部。 ### 不同区域的CCK8s-CCKBR相互作用决定不同G蛋白选择性。 ### CCK8s N端区域（T区域）决定Gs偏向 ### 位置： ### CCK8s前3个氨基酸： ### D1 ### Y2 ### M3 ### 作用： ### 突变D1/Y2/M3后： ### → Gs激活能力下降最明显 ### 而Gi、Gq影响较小。 ### 关键相互作用： ### CCK8s： ### Y2 ### M3 ### 与CCKBR： ### P114 ### Q204ECL2 ### H364ECL3 ### 形成较强结合。 ### 突变这些受体残基： ### P114A ### Q204A ### H364A ### 导致： ### → Gs信号显著下降。 ### 结论： ### CCK8s N端区域与CCKBR P114/Q204/H364形成热点，是CCKBR-Gs选择性激活的关键。 ### CCK8s中间区域（M区域）决定Gq偏向 ### 关键残基： ### M6 ### D7 ### 突变： ### M6A ### D7A ### 结果： ### → 主要降低Gq信号 ### 对Gs和Gi影响较小。 ### 关键结合位点： ### CCK8s： ### M6 ### D7 ### 结合CCKBR： ### F110²·⁶⁰ ### H207ECL2 ### N353⁶·⁵⁵ ### 突变： ### F110A ### H207F ### N353A ### 导致： ### → Gq激活能力明显降低。 ### 结论： ### CCK8s中间区域与F110/H207/N353相互作用，是CCKBR-Gq选择性的结构基础。 ### CCK8s C端区域（B区域）决定Gi偏向 ### 关键残基： ### F8 ### 作用： ### F8与： ### W346⁶·⁴⁸ ### 形成结合， ### 并通过： ### Y350⁵·⁵² ### 间接稳定。 ### C端还与： ### T111²·⁶¹ ### H376⁷·³⁹ ### 形成极性相互作用。 ### 突变： ### F8A ### T111A ### H376A ### Y380A ### 结果： ### → 选择性削弱Gi信号 ### 不同区域对应不同G蛋白偏向 |CCK8s区域|关键残基|主要影响信号| | --- | --- | --- | |T区域（N端）|D1/Y2/M3|Gs| |M区域（中间）|M6/D7|Gq| |B区域（C端）|F8|Gi| ### 研究意义 ### 结构和功能实验共同证明： ### CCKBR不同构象状态决定G蛋白选择性； ### 配体与受体不同区域的相互作用决定信号偏向。 ### 因此可以通过： ### 靶向CCKBR特定结合区域 → 设计偏向性激动剂 ### 例如： ### Gs偏向激动剂 ### Gq偏向激动剂 ### Gi偏向激动剂 ### 用于精准调控AD相关神经功能。  ### 结果3、基于结构设计CCKBR-Gi偏向性激动剂（Lyz-866和z-44） ### 设计思路 ### 为研究CCKBR-Gi信号功能，作者设计Gi偏向性激动剂。 ### 由于删除CCK8s前4个氨基酸可： ### 消除CCKAR激活； ### 保留CCKBR活性； ### 因此选择CCK4（W5-M6-D7-F8）作为模板，开发CCKBR选择性激动剂。 ### Lyz-866的设计与优化 ### 计算模拟发现： ### 对CCK4 N端进行乙酰化（Ac-CCK4）可增强其与CCKBR H364ECL3的氢键作用； ### Gi信号激活能力提高约2.5倍。 ### 在苯丙氨酸（F8）侧链引入溴原子形成 Lyz-866： ### 活性提高约8倍（EC50≈0.27 nM）； ### 生物利用度提高； ### 对CCKBR具有选择性。 ### 功能实验显示： ### Lyz-866是CCKBR Gi偏向性激动剂。 ### Lyz-866结构机制 ### 冷冻电镜解析： ### Lyz-866与CCK8s的W5-M6-D7-F8区域具有类似构象。 ### 但存在增强作用的关键相互作用： ### ① N端乙酰基： ### 与CCKBR H364ECL3形成额外氢键； ### ② 主链： ### 与 V206ECL2形成额外作用； ### ③ C端溴代苯环： ### 旋转约30°； ### 与疏水口袋形成更强堆积。 ### 突变H364或V206： ### → 显著降低Lyz-866活性。 ### 说明这些位点决定Lyz-866增强活性。 ### 进一步设计高度Gi偏向激动剂z-44 ### 问题： ### Lyz-866虽然偏向Gi，但仍与： ### H207ECL2（Gq相关位点） ### H3767.39/Y3807.43（Gi相关位点） ### 同时作用。 ### 设计策略： ### 删除Lyz-866 N端两个残基； ### 减少与H207ECL2（Gq相关）的作用； ### 优化D7和F8结构。 ### 最终获得： ### z-44 ### 特点： ### 完全失去： ### Gs激活能力； ### Gq激活能力； ### 保留： ### Gi激活能力。 ### 因此： ### z-44是高度Gi偏向性的CCKBR激动剂。 ### z-44结构基础 ### cryo-EM显示： ### z-44采用类似Lyz-866 C端D7-F8的线性构象； ### 位于配体结合口袋底部。 ### 关键作用： ### D7替换为羟基苯结构后： ### 增强与H3767.39和Y3807.43结合； ### 诱导这两个残基重新定位； ### 强化Gi信号。 ### CCKBR选择性的结构基础 ### Lyz-866和z-44： ### 激活CCKBR； ### 不激活CCKAR。 ### 原因： ### CCKBR特异残基： ### TM3区域： ### M1343.32 ### V1383.36 ### TM6区域： ### H3767.39 ### Y3807.43 ### 决定CCKBR选择性。 ### 突变这些位点： ### → z-44和Lyz-866活性下降。  ### 结果4、基于结构设计CCKBR-Gq偏向性激动剂3r1 ### 设计思路：利用Lyz-866结构开发Gq偏向激动剂 ### 作者解析了 Lyz-866-CCKBR-Gq复合物结构，以Lyz-866为模板设计Gq偏向性激动剂。 ### 重点保留核心药效区域： ### W5 ### M6 ### D7 ### 作为Gq激活的结构基础。 ### Lyz-866结合CCKBR-Gq与Gi存在构象差异 ### 比较Lyz-866-CCKBR-Gq和Lyz-866-CCKBR-Gi结构发现： ### D7侧链旋转约60° ### 伴随R356⁶·⁵⁸远离W5； ### 改变受体构象。 ### M6附近疏水作用重新排列： ### F110²·⁶⁰ ### F120ECL1 ### F122ECL1 ### 与M6相互作用减少。 ### C端F8-Br旋转约35°； ### 引起CCKBR构象开关残基变化： ### W346⁶·⁴⁸ ### H376⁷·³⁹ ### Y380⁷·⁴³ ### 说明： ### 配体诱导CCKBR不同构象，是G蛋白偏向性的结构基础。 ### 基于Lyz-866筛选Gq偏向性化合物 ### 作者对Lyz-866进行结构改造： ### W5位点优化： ### 替换： ### 苯丙氨酸（W5） ### 亮氨酸 ### 丙氨酸 ### 得到： ### a1-a3 ### 结果： ### → CCKBR活性明显下降。 ### D7位点优化： ### 替换： ### 氨基丙二酸 ### 谷氨酸 ### 组氨酸 ### 得到： ### c1-c3 ### 结果： ### → 活性降低。 ### 说明： ### W5和D7对CCKBR激活非常关键。 ### 4. 发现高效Gq偏向激动剂3r1 ### 关键改造： ### 将M6替换为： ### DL-norleucine（DL-正亮氨酸） ### 获得： ### 3r1 ### 特点： ### Gq激活能力提高约1000倍； ### EC50 = 0.035 ± 0.003 nM； ### 最大效应（Emax）： ### 约为CCK8s的159%； ### 同时： ### Gi激活基本不变。 ### 因此： ### 3r1是CCKBR高度Gq偏向性激动剂。 ### 偏向因子： ### β = 0.99 ± 0.20 ### 5. 3r1-CCKBR-Gq结构揭示Gq偏向机制 ### 冷冻电镜解析： ### M6→DL-norleucine改变 ### 导致： ### 与V130³·²⁸、M134³·³²疏水作用消失； ### 更靠近T111²·⁶¹； ### 整个配体上移约1 Å。 ### 结果： ### 增强： ### D7与H207ECL2； ### D7与R356⁶·⁵⁸ ### 相互作用； ### 减少： ### 与N353⁶·⁵⁵作用。 ### F8-Br构象变化 ### F8-Br旋转约150°： ### 减少： ### Br与V349⁶·⁵²/Y350⁶·⁵³作用； ### 增加： ### Br与： ### M186⁴·⁵⁷ ### Y189⁴·⁶⁰ ### L222⁵·⁴² ### 相互作用。 ### 6. 3r1关键结合热点 ### 突变实验发现： ### 以下残基决定3r1高活性和Gq偏向： ### Y189⁴·⁶⁰ ### H207ECL2 ### R356⁶·⁵³ ### 这些位点增强： ### CCKBR结合亲和力； ### Gq信号激活。  ### 结果5、3r1通过上调ADAM10和PLCB4发挥其有益作用 ### 体外实验：3r1浓度依赖性地提高Aβ42处理的神经元存活率，促进神经元分支和轴突生长，而z-44无保护作用。 ### 体内行为学：长期给予3r1能显著改善5×FAD小鼠在水迷宫和新物体识别实验中的学习记忆能力，而z-44和CCK8s无效。 ### 突触功能：3r1和CCK8s均能挽救AD小鼠海马长时程增强（LTP）的损伤。 ### Tau病理：3r1能显著降低AD小鼠皮层磷酸化Tau水平，而z-44和CCK8s无此效应。 ### 结论：Gq偏向性CCKBR配体3r1通过减轻神经元凋亡、改善突触可塑性和降低Tau磷酸化，有效缓解AD模型小鼠的学习记忆障碍，而Gi偏向性配体z-44无效，提示Gq信号通路在CCKBR介导的AD治疗中起关键作用。  ### 结果6、3r1改善AD模型小鼠认知功能的分子机制 ### 减轻Aβ病理：3r1显著减少5×FAD小鼠脑内淀粉样斑块数量。 ### 转录组分析：3r1上调海马中“钙信号通路”和“cGMP-PKG通路”相关基因，下调“AD通路”相关基因。 ### 调控分泌酶平衡：3r1特异性上调α-分泌酶（ADAM10）的表达和活性（mRNA和蛋白水平均升高），增加无毒性的sAPPα生成，而对β-和γ-分泌酶无影响；使用ADAM10抑制剂可阻断3r1的神经保护效应。 ### PLCB4是关键下游分子：3r1通过CCKBR-Gq信号上调Plcb4表达；敲低Plcb4可阻断3r1对神经元分支、轴突生长和抗凋亡的保护作用。 ### 信号通路完整链条：3r1 → CCKBR → Gq → PLCB4 → ADAM10上调 → 减少Aβ生成 + 促进神经元生长 → 改善认知功能（图7总结）。 ### 抗炎作用：3r1还降低了海马中促炎基因的表达。 ### 结论：3r1通过激活CCKBR-Gq-PLCB4-ADAM10信号轴，同时发挥抗Aβ病理、促神经元存活和抗炎等多重效应，从而在AD模型中实现认知保护。这进一步证实了Gq偏向性CCKBR信号在AD治疗中的关键地位。   ### 最后，来看看方法 ### 分子对接  ### 分子动力学   ### 生活很好，有你更好。
